免疫组化(IHC)通过级联放大系统实现靶蛋白可视化:
三明治结构
小鼠源一抗 → 抗小鼠二抗(酶标记) → 显色底物
二抗常见标记:
HRP(辣根过氧化物酶):DAB显色(棕)
AP(碱性磷酸酶):Fast Red显色(红)
信号放大技术:
生物素-链霉亲和素(B-SA)系统
聚合物偶联(如EnVision™)
特异性保障
二抗经过种属吸附处理(抗兔/大鼠IgG吸附)
含内源性IgG阻断剂(减少非特异结合)
试剂盒组成:
抗小鼠HRP聚合物二抗
DAB显色套装
内源性过氧化物酶阻断剂
抗原修复液(pH6.0/9.0)
稳定性控制
二抗:4℃避光保存(HRP标记物禁止冻存)
DAB浓缩液:-20℃分装(避免反复冻融)
生物安全
DAB废液处理:
用10%次氯酸钠氧化
按有害化学废液处置
含叠氮钠试剂:严禁与铜/铅接触(易爆炸)
关键参数优化:
| 步骤 | 优化要点 |
|---|---|
| 抗原修复 | 膜蛋白推荐EDTA(pH9.0)修复 |
| 二抗稀释 | 通常1:100-1:200(需预实验滴定) |
| 显色控制 | 肺癌等富抗原组织显色时间减半 |
对照设置(必做)
阳性对照:已知阳性组织(如CD3阳性的淋巴组织)
阴性对照:
空白对照(PBS替代一抗)
同型对照(小鼠IgG1κ)
常见问题排错
| 问题现象 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 全片着色 | 二抗浓度过高 | 提高稀释比至1:500 |
| 背景颗粒 | 组织干燥 | 保持样本湿润 |
| 信号弱 | 修复不足 | 改用高压修复121℃ 10min |
| 评分 | 染色特征 | 临床意义 |
|---|---|---|
| 0 | 无着色 | 阴性 |
| 1+ | 微弱染色 | 临界值 |
| 2+ | 中度染色 | 阳性 |
| 3+ | 强染色 | 高表达 |
亚细胞定位:
核(如p53)
胞质(如CD68)
膜(如CD20)