染色原理
番红（Safranin O） 和 固绿（Fast Green FCF） 是植物组织学中常用的复染剂，主要用于区分植物组织中的不同结构：
番红（红色）：
碱性染料，主要与木质化、栓质化、角质化的细胞壁（如导管、纤维、厚壁细胞）结合，呈现红色或粉红色。
也可染细胞核（因含核酸）。
固绿（绿色）：
酸性染料，与纤维素细胞壁（如薄壁组织、韧皮部）结合，呈现绿色。
对比效果：木质化结构（红）与纤维素结构（绿）形成鲜明对比，便于观察植物组织分化（如根、茎横切面）。
常见问题及解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 染色过浅 | 染色时间不足或染液失效 | 延长染色时间或更换染液 |
| 背景过深 | 固绿过染或水洗不充分 | 缩短固绿时间，加强水洗 |
| 组织脱落 | 载玻片未包被或脱水不彻底 | 使用多聚赖氨酸载玻片，优化脱水步骤 |
| 透明不彻底 | 脱水不完全或透明剂失效 | 重新脱水，更换透明剂 |
总结
应用场景：植物解剖学（如维管束分化）、病理学（如木质部坏死）研究。
关键点：
番红染木质化结构，固绿染纤维素结构，二者需时间精准控制。
脱水透明是封片清晰度的关键步骤。
替代方案：
如需观察更细腻结构，可结合甲苯胺蓝或苏木精染色。
实验步骤
试剂盒通常包含：
番红染液（0.1%~1%水溶液或酒精溶液）
固绿染液（0.1%~0.5%酒精溶液）
脱水乙醇（梯度浓度）
透明剂（二甲苯或替代品）
1. 样本制备
固定：植物材料用FAA（甲醛-乙酸-酒精）或4%多聚甲醛固定24小时。
脱水：梯度乙醇（50%→70%→85%→95%→100%）逐级脱水，每级1~2小时。
透明：二甲苯或叔丁醇透明，石蜡包埋。
切片：用切片机切5~8μm薄片，贴附于载玻片，60℃烘片30分钟。
2. 染色流程
脱蜡至水：
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟→100%乙醇→95%→85%→70%→50%→蒸馏水，每级2~5分钟。
番红染色：
滴加1%番红水溶液，染5~10分钟（或延长至30分钟增强木质部染色）。
水洗：
流水冲洗多余染液，直至水无色（约30秒）。
脱水：
50%乙醇→70%乙醇，各30秒。
固绿复染：
0.1%固绿（95%乙醇溶液）染10~30秒（时间需严格控制，避免过染）。
快速脱水：
95%乙醇→100%乙醇，各10~20秒。
透明：
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5分钟。
封片：
中性树胶封片，避免气泡。
3. 镜检结果
木质化组织（导管、纤维、石细胞）：红色。
纤维素组织（薄壁细胞、韧皮部）：绿色。
细胞核：红色（番红染色）。
注意事项
1. 样本处理
固定充分：避免组织自溶，尤其是幼嫩组织。
切片厚度：过厚（>10μm）易导致染色不均，建议5~8μm。
2. 染色控制
番红时间：
木质化程度高的组织（如老茎）需延长染色时间（20~30分钟）。
固绿时间：
仅需10~30秒，过长会覆盖番红染色。
水洗步骤：
番红后水洗需充分，但避免水流直接冲击样本。
3. 脱水与透明
梯度乙醇：脱水不彻底会导致透明失败（组织发白）。
二甲苯替代：可用环保透明剂（如柠檬烯），但需调整时间。
4. 安全与废液处理
二甲苯有毒：需通风橱操作，废液回收。
番红/固绿废液：按有机废液处理。