一、原理
Western Blot基于抗原-抗体特异性结合，用于检测样品中特定蛋白质的存在及表达量。通过以下步骤实现：
电泳分离：利用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）按分子量分离蛋白质。
转膜：将分离的蛋白质转移到固相载体（如PVDF膜或硝酸纤维素膜）上。
抗体检测：依次使用一抗（特异性结合目标蛋白）和标记的二抗（如HRP或荧光标记）进行孵育。
信号可视化：通过化学发光、显色或荧光成像显示结果，确定目标蛋白的分子量和表达量。
二、实验步骤
样品制备
· 裂解细胞或组织，提取总蛋白（含SDS、蛋白酶抑制剂）。
· 离心取上清，测定蛋白浓度并调整至一致。
· 加入上样缓冲液，煮沸使蛋白变性（95℃, 5分钟）。
SDS-PAGE电泳
· 配制凝胶（浓缩胶和分离胶），按分子量选择分离胶浓度（如8%-15%）。
· 上样后电泳：浓缩胶阶段低压（80V），分离胶阶段高压（120V），至溴酚蓝迁移至胶底。
转膜
· 湿转法：将凝胶与膜置于转膜装置，恒流（200-400 mA）转膜1-2小时（根据蛋白大小优化）。
· 膜选择：硝酸纤维素膜（小蛋白）或PVDF膜（需甲醇激活，适合大蛋白）。
· 验证：用丽春红短暂染色确认转膜效果。
封闭
· 用5%脱脂奶粉或3% BSA的TBST溶液封闭1小时（室温）或4℃过夜，阻断非特异性结合。
一抗孵育
· 加入稀释的一抗（按说明书比例，常用1:1000），4℃孵育过夜或室温2小时。
· TBST洗涤3次，每次5分钟，去除未结合抗体。
二抗孵育
· 加入HRP/荧光标记的二抗（如羊抗兔IgG，1:5000稀释），室温孵育1小时。
· 再次TBST洗涤3次，每次5分钟。
信号检测
· 化学发光法：ECL底物孵育后，用X光片或化学发光成像系统捕获信号。
· 荧光法：直接扫描荧光信号。
· 内参对照：同步检测β-actin/GAPDH，确保上样量一致。
三、注意事项与常见问题
· 关键点：避免蛋白降解、优化电泳/转膜条件、彻底封闭和洗涤。
· 常见问题：
· 高背景：延长封闭时间、更换封闭剂（BSA代替奶粉）、稀释抗体。
· 无信号：检查抗体活性、优化转膜效率、增加上样量。
· 非特异条带：验证抗体特异性、调整一抗浓度。
四、总结
Western Blot结合电泳分离与免疫学检测，是蛋白质分析的经典技术。实验成功依赖于每一步的精细操作和条件优化，需结合内参对照及多次重复确保结果可靠性。